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        四川大學學報(醫學版), 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506

        用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略

          通訊作者: 李燕, feifeiliyan@163.com ; 
        • doi: 10.12182/20200360506

        Column: Spotlights on COVID-19


        Biological Product Development Strategies for Prevention and Treatment of Coronavirus Disease 2019

          Corresponding author: LI Yan, feifeiliyan@163.com ;

          四川大學學報(醫學版), 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506

          用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略


          摘要: 新型冠狀病毒,又稱嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2),它引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)目前已成為全球關注的突發公共衛生事件。SARS-CoV-2感染人數眾多,傳播性極強,病死率較高,亟需尋求安全高效的特異制劑用于病毒感染的防治。目前在烈性傳染病防治中廣泛應用的生物制品,在阻斷SARS-CoV-2感染上同樣極具潛力。本文根據嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)和中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)已有的防治策略及研發進展,對干擾素、恢復期血漿、腸道微生態調節劑、疫苗、抗體等生物制品的應用經驗和研發命運進行綜述,為早日攻克COVID-19提供依據。

          根據2015版中國藥典的定義,生物制品是指以微生物、細胞、動物或人源化組織和體液為原材料,應用生物學技術制備,用于預防、治療和診斷人類疾病的制劑,如疫苗、血液制品、生物技術藥物、微生態制劑、免疫調節劑、診斷制品等。國家衛健委發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中指出[1],將α-干擾素霧化納入一般抗病毒療法,康復者血漿用于重型、危重型患者治療,腸道微生態調節劑可用于輔助治療措施,兒童重癥、危重型病例可酌情考慮使用靜脈滴注丙種球蛋白。針對病毒有可能長期存在的預期,最有效的預防方法就是研制特異性的疫苗,而中和性抗體將是特效治療制劑。目前全國正在爭分奪秒的研發特效生物制劑,期望通過疫苗的主動免疫和特異性抗體的被動免疫,有效防治新型冠狀病毒肺炎,盡快消除疫情。有效和特異—這兩種優點將生物制品置于防控領域重點研發和潛在應用的焦點。本文以2003年暴發的嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)和2012年暴發的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)疫情為鑒,選擇可能對新型冠狀病毒肺炎具有防治作用的生物制品進行全面綜述。

          新型冠狀病毒又名嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2),由其引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 19, COVID-19)自2019年12月起在湖北省武漢市暴發,隨即迅速席卷全國,目前已在全球多個國家和地區陸續發現確診病例。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒[2],與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)同屬β屬b譜系,在全基因組序列上有79%左右的相似性,受體結合域(receptor binding domain, RBD)同源性達到73%,是SARS-CoV的姊妹病毒,但兩者編碼的附屬蛋白有差異,如SARS-CoV-2缺乏8a蛋白,編碼的8b蛋白(121個氨基酸)的長度要長于SARS-Cov(84個氨基酸),3b蛋白也存在差異,總體上差異380個氨基酸位點[3]。而且SARS-CoV-2編碼的刺突蛋白(spike protein, S)與血管緊縮素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)的平衡解離常數為14.7 nmol/L,提示其親和力(與平衡解離常數呈反比)比 SARS-CoV(325.8 nmol/L)高22倍左右。S蛋白及其輔助蛋白組成和功能的差異,部分解釋了兩種病毒在傳染強度、肺炎病癥、致死率等方面明顯不同的原因。中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS‐CoV)屬于β屬c群,與SARS-Cov-2的全基因組序列相似性為50%左右,S蛋白及RBD區與SARS-CoV-2差異很大。目前認為3種冠狀病毒的自然宿主均為蝙蝠,其中SARS-CoV的中間宿主為果子貍,MERS-CoV的中間宿主是駱駝,而SARS-CoV-2的潛在中間宿主為穿山甲。

          動物細胞受到某些病毒感染后會分泌具有抗病毒功能的宿主特異性蛋白質(主要為糖蛋白),稱為干擾素(interferon, IFN)。IFN是廣譜的抗病毒生物制劑,傳統方法通過血源提取制備,現廣泛應用基因工程技術進行生產。目前人體產生的已知IFN共有13種,分為IFN-α、β、γ、λ等,其中IFN-α由固有免疫細胞分泌,在病毒感染的早期即可控制病毒的生長和繁殖。在抗擊SARS和MERS時期,IFN與其他藥物的聯合得到廣泛應用。INF-α聯合利巴韋林已成功應用于SARS的初級預防和治療,治療MERS-CoV感染的動物模型同樣有效[4],但AL-TAWFIIQ等[5]進一步發現二者聯用對MERS-CoV感染患者并沒有達到理想的治療效果,其推測可能與給藥時間不同有關。根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》推薦,可嘗試將INF-α霧化吸入,或與洛匹那韋/利托那韋聯合應用于COVID-19的一般抗病毒治療。也有人嘗試進行INF-α皮下注射給藥。例如,陳岷等[6]通過對SARS和MERS臨床治療相關的文獻檢索篩選,納入3篇指南、8篇臨床研究進行回顧性分析,評價皮下注射INF-α在COVID-19治療中的可能性,他們認為:①皮下注射IFN-α應盡可能在確診冠狀病毒感染后48 h使用,因為隨著用藥時間與確診時間的延長,有效率會降低。②各類型IFN的治療效果差異無統計學意義。③皮下注射IFN-α與利巴韋林口服聯合使用在個別研究中證實有效,但仍需要警惕其不良反應。

          目前有報道,細胞因子如IFN-β和IFN-γ也可以刺激ACE2的表達,進一步促進(而不是對抗)病毒的感染和播散[7]。針對這一報道,我們認為,首先,IFN的抗病毒作用肯定且經歷了長時間的考驗;其次,該研究通過體外細胞實驗觀察到了IFN刺激ACE2表達這一現象,但需要進一步證實,而且該研究也沒有報道IFN-α是否具有此作用。我們推測,IFN抗病毒作用在前,促受體表達在后。例如一篇研究[8]報道了SARS-CoV感染小鼠引起炎性介質在肺中雙相表達,與兩波炎性細胞募集有關。感染第2—3天,被感染的肺泡細胞等分泌大量的因子IFN-α等,pDC等固有免疫系統的激活似乎在控制SARS-CoV復制中起重要作用。但是在感染第7天,細胞因子IFN-γ等增高,強烈的病毒特異性T細胞反應(尤其是CD4+ T細胞)與之有關。因此在感染的晚期,白細胞介導的抗病毒反應可能有助于清除SARS-CoV,但也可能導致炎癥風暴發生[8]。這就提示IFN的種類和應用時期很重要。在冠狀病毒感染早期,應用IFN-α主要是誘導細胞進入抗病毒狀態,對預防和緊急治療感染更有價值。而IFN-γ主要用于免疫調節而不是抗病毒作用。再者,通過揭示COVID-19患者“炎癥風暴”發現與SARS和MERS不同,IFN-γ這個指標在COVID-19輕、重癥組并無顯著差異[9]。而IFN-β在細胞中表達量少,且中國藥典目前并未收錄這一制劑。

          基因工程重組人IFN-ω最初是對IFN-α不敏感的乙型和丙型肝炎的治療用藥,但經過重新實驗和評價,認為它能夠在一定程度上抑制SARS-CoV,因此在SARS期間制成鼻噴劑供部分醫務人員預防使用,起到了有效阻斷病毒感染的作用[10]。

          靜脈注射人免疫球蛋白簡稱靜丙,生產原料主要來源于數千名健康捐獻者所捐獻的血漿,具有廣泛的細菌和病毒抗體譜。大劑量的靜丙應用可在短期將患者體內免疫球蛋白G(IgG)水平提高2~3倍,是臨床廣泛采用的一種廣譜抗病毒方法,也是一種被動免疫療法。SARS時期香港醫院對12例重癥患者使用了靜丙治療,6 d后患者影像學評分和需氧量均提高,10例患者經治療后康復,且沒有不良事件的報告[11]。新加坡的一家醫院采用甲潑尼龍(200 mg)和靜丙(0.4 g/kg)聯合用于16例重癥SARS患者治療,連用3 d后,與未用藥組相比其調整死亡危險比為0.41(95% CI 0.14~1.23, P=0.11),而且病情有更早恢復的跡象[12],但仍需要通過循證醫學的金標準—設計大樣本的隨機、雙盲、對照并執行嚴格的研究參數標準來進行臨床試驗。靜丙對MERS 和COVID-19的治療作用尚無文獻報道。

          對于傳染病治療,有一種非常傳統而古老的方法,就是采用恢復期患者血漿進行輸血療法,是一種被動免疫治療?;驹硎腔颊吒腥静≡w后,通過自身免疫系統產生針對病原體的抗體,獲取這些血漿抗體用于新患者,殺滅其體內病原體。這一治療方法已在SARS-CoV和MERS-CoV感染患者中得到了應用。2005年,YEH等[13]對3名感染了SARS-CoV的醫務人員在發現病情后的第10或11 d采用了恢復期血漿療法,在輸注恢復期血漿24 h后,血液檢測發現患者體內病毒低于檢測限,且體溫下降、肺部病變改善。MAIR-JENKINS等[14]運用Meta分析,發現恢復期血漿療法可降低SARS絕對病死率7%~23%,且在發病后14 d內接受治療效果越好,沒有不良反應事件或并發癥相關的報告。KO等[15]對3例MERS患者進行治療,有2例表現出中和活性,建議在8~14 d內使用抗體滴度≥1∶80恢復期血漿治療為好,這也為COVID-19恢復期血漿療法提供了一個參考。但是這些研究因為缺乏對照組,被認為不能從患者共患其他疾病、疾病階段或其他治療的影響中辨別恢復期血漿的療效。

          恢復期患者特異性血漿抗體一般可以存留6個月、一年或更長時間,并可能對同類病毒具有交叉保護性。MARKUS等[16]就發現,來自恢復期SARS患者的血清可交叉中和SARS-CoV-2,從而防止病毒對宿主細胞的侵入。針對COVID-19重癥患者采用恢復期血漿進行治療或許是一種行之有效的方法。目前已開展了康復患者免疫血漿制品和免疫球蛋白的制備,經過嚴格的血液生物安全性檢測、病毒滅活、抗病毒活性檢測等,已成功制備出用于臨床治療的免疫血漿。COVID-19康復者恢復期血漿臨床治療方案(試行第二版)建議檢測新型冠狀病毒血清IgG抗體定性呈反應性,定量抗體滴度不低于160,IgM抗體呈非反應性。適應癥為病程不超過3周,且病情進展較快、重癥、危重癥COVID-19患者[17]。有報道稱[18],截止2月底,全國已采集了544人次的血漿用于245例患者的臨床治療。對其中157例患者超過48 h的監測發現,91例患者的臨床指標和癥狀都有一些改變,但其安全性仍是值得考量和權衡的問題。相關專家建議,有必要將恢復期血漿和某一種或幾種細胞因子的拮抗劑形成協同治療組合,比如抑制細胞因子風暴的妥珠單抗,已納入試行第七版診療方案中。

          人體腸道微生物組是一個高度動態、深受環境影響并與人體生理狀態互動的微生態系統。SARS-CoV-2通過細胞受體ACE2進入宿主細胞。ACE2不僅在肺部組織表達,而且在消化系統中表達,單細胞測序顯示在回腸和結腸細胞表達最高,而胃部細胞的表達整體偏低[19]?!缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》也明確指出,確診患者糞便可檢測出新型冠狀病毒核酸。從目前收治的患者情況看,死亡病例多見于患有基礎病的中老年患者。隨著年齡的增加,老年人群腸道微生態穩定性和多樣性下降,致病菌比例上升,益生菌比例下降,導致腸道代謝吸收功能減弱、黏膜修復屏障功能受損、免疫系統功能下降,全身性感染的風險增高。因此,對于病毒引起繼發細菌感染或抗生素應用導致腸道菌群失調等情況,可嘗試使用腸道微生態調節劑,維持腸道微生態平衡。QIN等[20]通過宏基因組分析發現,抗病毒物質、益生菌及抗生素治療可以提高H7N9患者腸道有益菌的微生物多樣性及豐度。目前已有相關機構對益生菌制劑調控COVID-19腸道功能及菌群結構進行臨床研究。常見的微生態制劑包括乳酸桿菌、雙歧桿菌及益生菌合劑。值得注意的是在中國專家共識中,若需同時應用抗菌藥物,應加大益生菌劑量或錯開服藥時間,或選用對抗菌藥物不敏感的布拉氏酵母菌、酪酸菌和芽胞桿菌制劑[21]。近年來呼聲高漲的來自健康人群的糞菌移植可能對患者也有治療潛力。

          目前控制疾病流行最有效的方式是采用疫苗接種易感人群,因此研制一種安全有效的疫苗至關重要。隨著新型冠狀病毒基因組全序列提交至GenBank數據庫,以及病毒分離株原始種子的篩選,多種疫苗如滅活疫苗、亞單位疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗等均在緊急研發中。

          病毒分離株經適應性培養,經過鑒定生物學特性、免疫原性和遺傳穩定性后再通過滅活工藝(如使用甲醛、紫外線和β-丙內酯)制成的全病毒疫苗[22-23]。國內曾制備出甲醛滅活的SARS疫苗,免疫恒河猴后可誘導產生中和抗體,Ⅰ期人體臨床試驗顯示初步效果,36名受試者中有24名產生了抗體,但由于疫情結束未能開展Ⅱ期臨床試驗而擱淺[24]。目前國內多家研究單位成功分離了病毒,并進行了種子毒株的篩選,正在進行動物免疫實驗。滅活疫苗的優勢在于制備簡單,疫苗表面含有多種抗原蛋白能夠被免疫系統識別,能夠產生和病毒感染相似的抗原性。但由于需要大量擴增病毒,制備過程有感染的風險,病毒的其他蛋白也可能引起其他有害的免疫和炎癥反應。

          采用重組基因技術制備亞單位疫苗,具有安全性更高、穩定性更好,可快速實現規?;a等優勢。冠狀病毒S蛋白含有大量的抗原決定簇,在誘導中和抗體和T細胞免疫反應中起關鍵作用,因此S蛋白是SARS疫苗最有潛力的靶目標。S蛋白由兩個亞基組成,S1亞基含有RBD,是主要的抗原表位,S2亞基可介導病毒與宿主細胞的融合[25]?;赟ARS-CoV S蛋白的疫苗已有多家報道[26],發現全長S蛋白三聚體對小鼠或倉鼠進行疫苗接種可保護這些動物免受SARS-CoV的感染,S蛋白可誘導小鼠和非洲綠猴血清中中和抗體的產生。更進一步,ZHOU等[27]采用S1亞基的485-625和S2亞基1029-1192的表位多肽作為疫苗,可以誘導中和反應,使抗體水平增加。對MERS-CoV而言,大部分疫苗策略多聚焦在S蛋白S1亞基和RBD上,通過RBD重組蛋白多肽或者與人抗體FC片段結合成融合蛋白來制備抗原[28]。不過,由于SARS-CoV-2和SARS-CoV是姊妹病毒,結構相似性高但也存在編碼蛋白的差異,因此基于兩種病毒的S蛋白重組載體和生物信息學篩選的通用S抗原表位,研發可同時中和兩種病毒的通用疫苗更有價值。

          SARS病毒表達的其他蛋白如膜蛋白(membrane protein, M)、包膜蛋白(envelope protein, E)也能表達在病毒的表面,在患者血清中可以檢測到相應的保護性抗體。核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N)與RNA結合位于病毒核心,相對保守,多用于SARS-CoV-2的檢測,但也可以作為候選疫苗[25]。雖然抗N抗體在體外沒有病毒中和活性,但N蛋白能在體內誘導CD8+ T細胞反應,給免疫動物提供保護。因此,除了S蛋白,SARS-CoV-2其他結構蛋白E、M和N均有潛力作為候選疫苗。

          重組病毒載體疫苗是將外源保護性抗原基因插入到病毒基因組內獲得重組蛋白表達的一類載體疫苗。重組病毒載體疫苗具有插入外源基因長、接種途徑多及易生產制備等優點,已在疫苗研制中廣泛開展。常用的病毒載體包括腺病毒、痘苗病毒、副流感病毒等[29]。如將SARS病毒S和N編碼基因與腺病毒載體重組后免疫獼猴,能分別產生針對S蛋白的中和抗體和針對N蛋白的T細胞反應,同時誘導IFN-γ分泌增加。用減毒的副流感病毒作為載體編碼SARS-CoV S蛋白免疫非洲綠猴同樣能誘導特異性中和抗體產生。將S基因導入減毒痘苗病毒載體,免疫小鼠、兔和猴以后,均能誘導高水平中和抗體,將動物血清稀釋103~104仍能抑制50%的病毒。而將其中免疫老鼠的血清被動免疫幼鼠,同樣可以保護幼鼠抵抗病毒攻擊。預防MERS感染的病毒載體疫苗設計與SARS病毒類似[28]。不同的是,MERS冠狀病毒S蛋白通過結合病毒天然受體(DPP4)感染宿主細胞,但普通的小鼠無該受體,因此需要在攜帶有人源DPP4基因的轉基因小鼠驗證其抗原性和免疫原性。借鑒于SARS和MERS疫苗研發經驗,已有多個團隊正在開展SARS-Cov-2重組病毒載體疫苗研制。

          核酸疫苗(DNA/mRNA)也稱基因疫苗,是指將含有編碼蛋白的基因序列直接構建重組載體,經肌肉注射或微彈轟擊等方法導入宿主體內,通過宿主細胞表達抗原蛋白,誘導機體對該抗原蛋白的免疫應答,以達到預防疾病的目的。這種蛋白直接在體內合成,可以大大節約疫苗制備時間。YANG等[30]開發的基于SARS病毒S蛋白的DNA疫苗也在動物實驗取得了良好的效果,發現接種疫苗的小鼠肺部病毒的復制減少了106數量級以上。另外一項SARS的S、N、M蛋白的DNA疫苗比較研究顯示,上述疫苗都能產生不同類別的免疫反應,其中S蛋白誘導的體液免疫較強,而M蛋白引起的細胞免疫更強。因此,有必要進一步評估M抗原及其他輔助蛋白的潛在作用[31]。GLS-5300是首個進入臨床試驗基于MERS-CoV S蛋白全長序列的候選DNA疫苗,在小鼠、駱駝和恒河猴中都能誘導較強的細胞免疫和特異性中和抗體反應,可以一定程度上保護恒河猴免受MERS-CoV的攻擊,未出現臨床和影像學上肺炎的特征。Ⅰ期臨床試驗顯示GLS-5300具有可耐受的安全性和穩健的免疫原性[32]。與DNA疫苗相比,mRNA疫苗是一種新型核酸疫苗,可以向患者體內直接遞送mRNA,利用患者細胞內相應元件直接翻譯出蛋白片段。部分mRNA疫苗本身具有的疫苗佐劑特性,通過產生多種細胞因子等不同方式刺激免疫系統,加大抗體合成能力,在新型疫苗制備上具有極大的應用價值[33]。

          核酸疫苗制備時間短,但尚未有完成臨床試驗的成品疫苗,也未見文獻報道對SARS-CoV-2的研發嘗試,仍值得深入探索;傳統滅活或減毒疫苗,制備時間長,但技術相對成熟,目前上市的疫苗多為此類。重組蛋白抗原在體外制備,安全可控,可以快速實現應急疫苗的量產。上述不同制備方式的疫苗,目前均在緊急研發中。

          目前,全球治療性抗體的銷售市場以年均32%的速度增長,在生物類藥物中增長最快[34]。治療性抗體的顯著優勢是相對安全,同時具有功能強大和靶向性高的特點,是烈性病毒感染防控的特效藥物,例如已經研制出的針對埃博拉的抗體藥物ZMapp就取得了很好的效果[35]。

          針對病毒的中和抗體IgG一旦產生,不但量大而且持久,從而能有效地阻斷病毒再次進入機體內。一項針對SARS愈后的34名醫務工作者前瞻性研究顯示,此后的12年每年檢測他們的抗SARS-CoV IgG滴度仍保持在很高的水平,提示IgG的存在可能提供針對該病毒再感染和其他β冠狀病毒(如SARS-CoV-2)感染的保護能力[36]。除了多克隆抗體外,單克隆抗體(簡稱單抗)也是該領域最受矚目的發展方向和研究熱點,常規用雜交瘤技術,可產生高度均一、特異性高的抗體。目前針對冠狀病毒的單克隆抗體主要分為鼠源性單克隆抗體和人源化單克隆抗體,近期部分科研團隊采用記憶B細胞單克隆抗體制備技術,也為快速制備人源化抗體帶來了希望。

          5.1.1   鼠源性單克隆抗體

          目前的研究常用SARS-CoV病毒RBD抗原表位免疫小鼠,提取脾臟細胞與骨髓瘤細胞在聚乙二醇作用下進行細胞融合,采用選擇培養基對融合細胞進行篩選和亞克隆化培養,經純化制備IgG單抗。HE等[37]制備了小鼠單克隆抗體1A5和2C5,其中2C5能夠阻止RBD與ACE2的結合。RBD有6組構象依賴性表位,稱為Conf Ⅰ~Ⅵ,其中Conf Ⅵ和Conf Ⅴ單克隆抗體顯著阻斷了RBD融合蛋白與ACE2的結合[38]。上述小鼠單克隆抗體作為異源性蛋白,更常用于疾病診斷。

          5.1.2   人源化單克隆抗體

          人源性抗體可以彌補異源性抗體的不足。人源化單克隆抗體可通過EBV轉化B細胞克隆技術、噬菌體展示技術、轉基因人源化小鼠技術等來實現。LANZAVECCHIA團隊從一名SARS患者恢復期的血液中用EB病毒轉化B細胞克隆技術篩選針對不同病毒結構蛋白的單克隆抗體,其中有35種在體外具有中和活性,命名S3.1的單克隆抗體注射小鼠,攻毒實驗顯示可抑制上呼吸道病毒復制、下呼吸道免受病毒感染[39]。SUI等[40]利用噬菌體展示技術,篩選出了靶向S蛋白名為80R的單克隆抗體,注射老鼠可減少104的病毒增殖。用同樣的方法,篩選到m396和CR3014。利用現有的SARS病毒單抗,評估對SARS-CoV-2交叉反應性發現,某些單抗如CR3022可以與SARS-CoV-2 RBD有效結合,雖然抗原決定簇并不完全重疊。另外一些如m396、CR3014卻不能結合[41]。MERS的單克隆抗體也有多種,分離自MERS康復患者的單抗MCA1,0.39 μg/mL的質量濃度就能夠完全中和Vero E6細胞中的MERS病毒[42]。YING等[43]通過酵母展示技術制備了MERS-4和MERS-27,細胞水平具有非常強的抑制病毒效果,其機制是抗體與RBD結合導致其中一段loop的構象發生變化,進而破壞受體識別關鍵區域,間接行使抗病毒功能。ZHANG等[44]開發的超強活性抗體m336,與MERS冠狀病毒的結合親和力常數達到“皮摩爾”級別,已經在狨猴和兔子動物實驗中顯示有效。該抗體在與MERS病毒結合時,其結合面與DPP4的重疊面積高達90%以上,這一發現解釋了m336抗體為什么具有超強殺傷力。

          將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失的動物中,使動物表達人類抗體,達到抗體全人源化的目的是一項新技術,具有十分明顯的優勢,可針對不同抗原開發不同抗體,并且周期大大縮短。目前,國內已有研究單位開展人源化抗體轉基因小鼠制備抗SARS-COV-2抗體的工作,有希望成為疫情防控的應急抗體制劑[45]。

          5.1.3   單個B細胞抗體

          恢復期患者產生特異性抗體的細胞是B細胞,利用最新技術,可以實現對其中少量有中和作用、特異性的記憶B細胞進行抗體基因克隆后,獲得單克隆抗體,稱為單個B細胞克隆抗體,保證了輕重鏈可變區的天然配對,相較于傳統的抗體制備技術具有效率高、全人源、基因多樣性更豐富等優勢[46]。借鑒寨卡病毒單個B細胞抗體的技術路線,首先通過流式細胞分選從恢復期患者外周血分離B淋巴細胞,以病毒抗原E蛋白為誘餌,用熒光標記抗原分選到特異結合E蛋白的單個B細胞,體外反轉錄PCR擴增抗體基因,擴增產物測序分析,再將擴增抗體基因片段與IgG1的恒定區片段融合以生成全長單克隆抗體,在真核表達細胞如HEK293中進行抗體的表達。純化后用常規方法進一步測定抗體與抗原的特異性、親和力以及中和活性等生物學特性[47]。

          單個B細胞抗體實際上就是基因工程抗體技術,可以選擇與病毒中和性最好的抗體。相比血漿,抗體特異單一、保險、確定,將該技術也應用在H7N9和埃博拉抗體的制備中。近期有團隊采用COVID-19康復期患者B細胞單細胞測序的方法,嘗試體外抗體表達生產。

          卵黃抗體(immunoglobulinyolk, IgY)又稱卵黃免疫球蛋白,是指用特定的抗原免疫產蛋禽類后,從免疫禽蛋中獲得的針對免疫抗原產生的特異性抗體。胡國柱等[48]用滅活SARS-CoV免疫產蛋雞,制備得到特異性IgY,可用于SARS-CoV的預防及阻斷其傳播。KAMMILA等[49]利用SARS病毒的N抗原免疫產蛋雞,制備N特異性IgY,開發了一種快速檢測病毒感染的方法。由于IgY具有安全高效、快速制備、成本低廉特點,針對目前SARS-CoV-2的流行特征,可以制備其IgY,生產口服制劑用于殺滅消化系統病毒,也可制備成抗體噴劑用于手、口腔、鼻腔等進行黏膜病毒阻斷。

          通過對冠狀病毒SARS和MERS感染有關的生物制品的研究和應用的回顧,對目前COVID-19疫情防控具有重要的借鑒意義。IFN、生態制劑、恢復期血漿在對癥治療中發揮重要作用,疫苗研發和治療性抗體制備當然更被寄予厚望。期望通過應急攻關,在科學家和生物企業等多方合作下,制備出相應的主動免疫和被動免疫制劑,盡快打贏這場SARS-CoV-2病毒殲滅戰。



        參考文獻


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        四川大學學報(醫學版), 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506

        用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略


        引用本文: 晏彩霞, 李佳, 沈鑫, 等. 用于新型冠狀病毒肺炎防治的生物制品研究策略[J]. 四川大學學報(醫學版), 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506 
        Citation: YAN Cai-xia, LI Jia, SHEN Xin, et al. Biological Product Development Strategies for Prevention and Treatment of Coronavirus Disease 2019[J]. JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE EDITION), 2020, 51(2): 139-145. doi: 10.12182/20200360506 


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